一、噬菌体展示技术的基本原理

1.技术背景：噬菌体展示技术的革命性突破

1985 年，Smith 首次将外源基因插入丝状噬菌体外壳蛋白基因，实现了多肽在噬菌体表面的展示。1990 年，McCafferty 等人首次成功展示了功能性抗体片段，开创了噬菌体展示抗体技术的新纪元。

经过 30 余年的发展，噬菌体展示技术已成为抗体发现的三大核心技术之一（另外两种为转基因小鼠和单 B 细胞筛选）。与其他技术相比，噬菌体展示技术具有无需免疫、周期短、成本低、可针对任何靶点筛选等独特优势，特别适合快速先导分子发现和困难靶点抗体开发。

2.scFv 与 Fab 抗体库的核心差异

scFv（单链可变片段）和 Fab（抗原结合片段）是噬菌体展示技术中最常用的两种抗体形式，两者在结构和性能上存在显著差异：

3.噬菌体展示抗体库技术基本原理

噬菌体展示抗体库技术的核心原理是将抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因（通常为 pIII 基因）融合，使抗体分子展示在噬菌体表面，形成 "噬菌体 - 基因 - 抗体" 一一对应的关系。

技术流程概述：

● 从人外周血单个核细胞 (PBMC) 中提取 RNA，反转录为 cDNA

● 扩增抗体重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL/VK) 基因

● 组装成 scFv 或 Fab 基因片段

● 将抗体基因重组到噬菌粒载体上，与 pIII 蛋白融合

● 电转化大肠杆菌，构建噬菌体展示抗体库

● 通过多轮 "抗原结合 - 洗脱 - 扩增" 的淘选过程，富集特异性结合靶点的噬菌体

● 单克隆筛选和测序，获得抗体基因序列

4.噬菌体展示平台的优势

① 周期短、成本低：相比于传统的杂交瘤技术等方法，噬菌体展示技术筛选过程相对较短，最快1周即可获得候选分子；所需的实验材料主要是噬菌体和细菌，操作简单且费用低，适合大规模初筛。

② 可大规模筛选高特异性抗体：噬菌体展示技术能够在短时间内对数以百万甚至数十亿计的噬菌体克隆进行筛选，能针对几乎任何靶点包括毒素、病原菌和高度保守靶点（如泛素、组蛋白），快速获得与目标抗原特异性结合的抗体，大大提高了筛选的效率和速度。

③ 空间构象的准确性：噬菌体展示的抗体能够保持相对独立的空间结构和生物活性，这有利于筛选出具有正确构象和功能的抗体。

④ 兼容性强：可展示scFv、Fab、纳米抗体等多种抗体形式，并支持多价展示(如 pVIII 蛋白多拷贝展示)。

二、仁域生物优势-全新升级优化的技术路线 + 丰富的建库经验

1.抗体库多样化：包含Fab、scFv、VHH等。

2.宿主来源多样化：包含人、鼠、兔、骆驼、羊驼等。

3.全新升级的全人源抗体库引物：引入IMGT最新数据，优化简并度提升扩增效率，多样性更好。

4.极限提升的电击转化效率：单次电击转化效率高达到 1×10^10 。

5.十年技术积累：累计完成1000+ scFv/Fab/VHH Library；经验丰富的团队，以及对抗体库技术的深入理解，为您打造更高品质噬菌体展示抗体库。

6.服务可定制：仁域生物针对不同的要求提供专业的优化建库方法，为每一个客户量身定制实验方案，提供最高品质的抗体库定制服务，满足每一位客户的特殊需求。

三、标准噬菌体展示人源 scFv/Fab 抗体库技术流程

1.标准 scFv 天然抗体库构建流程（4-6 周交付）

第 1 阶段：样本采集与 PBMC 分离（1 周）

● 样本采集

①根据客户要求采集健康人外周血样本（通常 10-50mL / 人）

②记录供体信息（年龄、性别、地域、健康状况）

● PBMC 分离

①Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

②台盼蓝染色法检测细胞活力（要求＞90%）

③细胞计数，调整细胞浓度

● RNA 提取

①TRIzol 法提取总 RNA

②琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性（要求 RIN 值＞7）

③紫外分光光度法测定 RNA 浓度和纯度

第 2 阶段：cDNA 合成与抗体基因扩增（1 周）

● cDNA 合成

①以总 RNA 为模板，使用随机引物或特异性引物反转录合成 cDNA

②检测 cDNA 质量和浓度

● 抗体可变区基因扩增

①使用特异性引物分别扩增重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL/VK) 基因

②琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小（VH 约 350bp，VL 约 320bp）

③切胶纯化扩增产物

● scFv 基因组装

①通过重叠延伸 PCR 将 VH 和 VL 基因拼接成 scFv 基因（约 750bp）

②引入合适的酶切位点，便于后续克隆

③切胶纯化 scFv 基因片段

第 3 阶段：载体构建与电转化（1-2 周）

● 噬菌粒载体制备

①提取高质量的噬菌粒载体（如 pCOMB3、pHEN4）

②用相应的限制性内切酶进行双酶切

③切胶纯化线性化载体

● 连接反应

①将 scFv 基因片段与线性化载体进行连接

②优化连接条件，提高连接效率

● 电转化大肠杆菌

①制备高感受态大肠杆菌 TG1 或 XL1-Blue 细胞

②将连接产物电转化大肠杆菌

③优化电转化条件，提高转化效率

● 文库扩增

①将转化后的细胞接种到大型培养皿中，37℃ 培养过夜

②收集菌落，加入甘油，-80℃保存原始文库

③同时扩增噬菌体文库，测定滴度

第 4 阶段：文库质量鉴定（1 周）

● 库容测定

梯度稀释转化产物，涂布平板，计数菌落数，计算库容

● 插入率检测

随机挑取 96 个单克隆，进行 PCR 鉴定，计算插入率

● 序列多样性分析

①随机挑取 48-96 个阳性克隆进行 Sanger 测序

②分析序列多样性、入框率和家族分布

③（可选）进行 NGS 测序，全面评估抗体库多样性

● 滴度测定

测定扩增后噬菌体文库的滴度（要求＞1×10^12 pfu/mL）

第 5 阶段：项目交付与验收（1-3 天）

● 交付内容：完整的建库实验报告、原始噬菌体文库菌液、扩增后的噬菌体文库、文库质量鉴定数据、所有原始实验记录

● 客户验收：根据合同约定的验收标准进行验收，重点检查库容、插入率和多样性

● 技术支持：提供后续抗体筛选和使用的技术指导

2.Fab 抗体库构建流程（6-8 周交付）

Fab 抗体库构建流程与 scFv 抗体库基本相似，主要差异在于：

● 基因扩增：需要扩增重链可变区 + 恒定区 1 (VH-CH1) 和完整轻链 (VL-CL) 基因

● 载体构建：Fab 基因需要克隆到双顺反子载体中，同时表达重链和轻链

● 转化效率：Fab 片段较大，转化效率通常比 scFv 低 1-2 个数量级

● 建库周期：比 scFv 抗体库长 2-4 周

四、交付内容

● 高质量的噬菌体展示抗体库（甘油菌液）

● 详细的文库构建报告（包括容量、多样性、插入率等数据）

● 文库质量检测报告

● 后续筛选技术支持